Scandalisé par le commerce des indulgences instauré par les papes Jules II et Léon X pour financer la construction de la basilique Saint-Pierre de Rome, il publie le 31 octobre 1517 les 95 thèses.
Sommé le 15 juin 1520 par le pape Léon X de se rétracter, il est excommunié, le 3 janvier 1521, par la bulle pontificale Decet romanum pontificem. L'empereur du Saint-Empire romain germanique et roi d'Espagne, Charles Quint, convoque Martin Luther en 1521 devant la Diète de Worms. Un sauf-conduit lui est accordé afin qu'il puisse s'y rendre sans risque.
Devant la Diète de Worms, il refuse de se rétracter, se déclarant convaincu par le témoignage de l'Écriture et s'estimant soumis à l'autorité de la Bible et de sa conscience plutôt qu'à celle de la hiérarchie ecclésiastique. La Diète de Worms, sous la pression de Charles Quint, décide alors de mettre Martin Luther et ses disciples au ban de l'Empire.
Il est accueilli par son ami le prince-électeur de Saxe Frédéric III le Sage au château de la Wartbourg, où il compose ses textes les plus connus et les plus diffusés. C'est là qu'il se lance dans une traduction de la Bible en allemand à partir des textes originaux, traduction dont l'influence culturelle sera primordiale, tant pour la fixation de la langue allemande que pour l'établissement des principes de l'art de la traduction.